葡萄WRKY54基因克隆及表达特性分析

为了探究葡萄WRKY54基因的功能,以抗盐葡萄品种Vidal Blanc为材料,采用同源克隆法克隆得到Vv WRKY54基因,并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表明,Vv WRKY54基因c DNA序列为942 bp,编码313个氨基酸。生物信息学分析结果表明,Vv WRKY54蛋白分子量约为35.3091 k Da,等电点为5.45,不稳定系数为55.03,推测其为不稳定蛋白,与已知毛果杨及拟南芥WRKY54蛋白高度同源;亚细胞定位预测结果显示其主要存在于细胞核中。实时荧光定量PCR分析表明,Vv WRKY54在葡萄不同组织中均有表达,其中在梢尖中表达量最高;盐和低温等逆境胁迫因子均能诱导Vv WRKY54上调表达;此外,Vv WRKY54受水杨酸和一氧化氮诱导上调表达,其中水杨酸诱导Vv WRKY54相对表达量在12 h达到最大值,约为对照的50倍。推测Vv WRKY54在植物发育和抵御逆境胁迫中起着重要作用,这为进一步阐明Vv WRKY54的功能及作用机制奠定了分子基础。     

杨树微管功能研究植物表达载体构建及验证

[目的]分别构建84K杨的微管蛋白TUA5和TUB16与红色荧光蛋白mCherry融合的植物过表达载体,瞬时表达验证载体在植物体内表达后的荧光信号,为研究杨树微管功能奠定基础。[方法]以毛果杨微管蛋白TUA5和TUB16的基因序列为模板,设计84K杨的皿5和7TZB76基因的引物,提取野生型84K杨的RNA并反转录成cDNA,同源克隆得到84KTUA5和84KTUB16基因,分别连接在pCAMBIA 1300载体mCh-ep荧光标签的N,端和C端,转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中,通过菌落PCR和测序鉴定获得阳性单克隆,并通过电击法将重组质粒转化到农杆菌GV3101中,瞬时转化烟草后进行荧光观察。[结果]克隆得到了84KTUA5和84KTUB16基因,成功与pCAMBIA 1300-mCherry载体连接,烟草瞬时表达荧光观察结果显示:仅目的基因与mCherry标签C,端相连的融合蛋白能够成功表达,且荧光明显。[结论]成功构建了84K杨皿5和TUB16基因与pCAMBIA 1300-mCherry的融合表达载体,为进一步研究杨树微管功能提供了背景材料。     

Effects of dietary myrcene administration on antioxidant gene responses in common carp (Cyprinus carpio), exposed to copper sulphate

In the present study, common carp (Cyprinus carpio) were fed with diet supplemented with 0% (M0) or 0.5% (M0.5) myrcene for 6 week and exposed to ambient copper (0.2 mg/L) for further 2 weeks. Gene expressions of superoxide dismutase (sod), catalase (cat), glutathione peroxidase (gpx), glutathione reductase (gr) and glutathione S‐transferase (gst) were assayed in the fish brain and kidney, and thiobarbituric reactive substance (TBARS) levels were determined in blood plasma. The results showed that there was no significant difference in TBARS levels between the M0 and M0.5 treatments, before the copper exposure; however, the M0 had significantly higher TBARS levels compared to the M0.5, after the copper exposure. The antioxidant genes showed different patterns in the fish brain and kidney. The genes were up‐regulated in the fish brain by dietary myrcene and copper exposure. However, in the fish kidney, the M0.5 treatment showed no change in sod, cat, gpx before and after the copper exposure. The results suggest that myrcene is capable to induce antioxidant enzymes that prepare the fish for a further oxidative condition (i.e. copper exposure). Dietary myrcene at 0.5% level is suggested for common carp before treatment with copper sulphate.     

可可毛色二孢全基因组分泌蛋白的预测及分析

【目的】可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的葡萄溃疡病（Botryosphaeria dieback）,影响果木品质并造成巨大的经济损失。本研究预测并分析可可毛色二孢基因组范围内的分泌蛋白,并明确其基本特征,为该病菌分泌蛋白致病机理的研究打下基础。【方法】依据已公布的可可毛色二孢全基因组序列,利用信号肽预测软件SignalP v5.0、跨膜结构分析软件TMHMM v2.0、细胞器定位分析软件ProtComp v9.0、GPI锚定预测软件big-PI Fungal Predictor和亚细胞器定位分析软件TargetP v2.0生物信息学软件对该菌中的典型分泌蛋白进行筛选。对分泌蛋白N端信号肽的长度、氨基酸使用频率及其切割位点进行统计分析。依据蛋白序列的同源性,应用BLASTP程序对分泌组蛋白进行功能注释分析,预测其生物学功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统,对所选分泌蛋白的信号肽进行活性检测。利用qRT-PCR方法检测所选分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表达情况。【结果】在可可毛色二孢全基因组编码蛋白中共筛选获得552个潜在的具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组预测蛋白总数的4.3%,其编码蛋白长度集中于101—400 aa。信号肽统计分析表明,其信号肽长度以18—20 aa的序列最为集中,信号肽长度为20 aa的蛋白数量最多。信号肽中使用频率最高的氨基酸为丙氨酸;非极性、疏水的氨基酸使用频率最高,占氨基酸总数的60.2%。其信号肽的-3至-1位置上的氨基酸相对保守,切割位点属于A-X-A类型,可被Sp I型信号肽酶识别并切割。336个分泌蛋白具有功能注释,其功能较多集中于细胞壁降解有关的酶类以及致病相关蛋白,并且这些蛋白在分子量、等电点、脂肪族氨基酸指数等方面均存在差异。通过蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统证实,挑选的9个分泌蛋白信号肽均具有分泌活性。qRT-PCR检测结果表明,所选分泌蛋白基因在该病菌侵染初期的表达发生变化。【结论】利用生物信息学分析技术从可可毛色二孢全基因组中共预测获得552个经典分泌蛋白。其信号肽氨基酸长度分布广泛,氨基酸组成中非极性、疏水的氨基酸使用频率最高。功能注释主要集中在细胞壁组分降解相关的酶类、致病侵染相关的坏死诱导相关蛋白以及几丁质结合蛋白等。     

环状RNA及其在生殖发育中的研究进展

环状RNA（circular RNA，circ-RNA）是一类由初始转录RNA反向剪接，形成的闭合环状RNA分子，广泛存在于真核细胞中。因不受RNA外切酶切割，所以稳定存在时间长。主要通过海绵吸附作用竞争性结合miRNA调节基因表达。circ-RNA分子鉴定及其生理调控作用成为近几年生命科学领域的研究热点，本文从circ-RNA的生成过程、在早期胚胎发育调控以及配子发育过程中的数量和作用等方面进行了综述。     

草鱼TAB1蛋白的原核重组表达及其抗体制备

为了制备草鱼重组TAB1蛋白(rCiTAB1)及其特异性抗体,首先以草鱼头肾组织c DNA为模板,PCR扩增Ci TAB1基因全长序列,并依次构建重组克隆质粒p MD19-T-Ci TAB1与重组表达质粒pET-32a-Ci TAB1。该重组表达质粒经0.5 mmol·L~(-1) IPTG,37℃诱导表达12 h后获得以包涵体形式表达的重组CiTAB1蛋白(rCiTAB1)。然后,采用3种不同方法对包涵体蛋白进行变性,发现与高浓度尿素直接变性法和洗涤后尿素变性法相比,洗涤后梯度尿素变性法处理后的蛋白纯度最好,经透析复性后得到浓度为2 mg·mL~(-1)的r Ci TAB1。最后,将rCiTAB1蛋白与白油佐剂及免疫增强剂混合,室温下混合1.5h乳化成免疫原,3次免疫新西兰大白兔制备兔抗CiTAB1抗体,经间接ELISA方法和免疫琼脂双向扩散试验测得免疫后第33天血清中特异性抗体的效价分别为1∶1 048 576和1∶16。Western blot检测到一条分子量约为72 kDa的特异性条带,表明该抗体能特异性识别r Ci TAB1蛋白。研究结果为后续深入研究CiTAB1蛋白功能提供了物质基础。     

草果AtNCED基因克隆、表达和植物表达载体构建

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)是ABA生物合成的限速酶。诸多研究表明NCED基因表达量的变化与ABA含量显著相关,在种子休眠过程中发挥重要作用。为探究草果AtNCED基因的序列特征和功能,本研究以草果(Amomum tsaoko Crevost et Lemarie)种子转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了一个AtNCED基因。该基因全长2 372 bp,包含一个1 830 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码610个氨基酸。生物信息学分析显示,AtNCED基因编码的蛋白在N-末端包含典型的叶绿体转运肽序列,在催化结构域含有4个高度保守的组氨酸残基。AtNCED蛋白与芭蕉科马来西亚蕉同源性较高,与其他单子叶植物处在同一进化分支。实时荧光定量PCR分析结果表明,AtNCED基因表达量随着层积时间的增加逐渐下降,该基因可能正向调控种子休眠,在草果种子休眠诱导与维持中发挥重要作用。进一步地,利用同源重组方法,成功构建了pBI121-AtNCED过表达载体,并转化至农杆菌EHA105。该研究结果为弄清ABA激素信号在种子休眠中的调控作用提供了帮助。     

玉米HD-ZIP I亚家族基因鉴定及表达分析

转录因子是植物响应逆境胁迫的重要调节因子,在其整个生长发育过程中发挥着重要的作用。HD-ZIP家族蛋白是植物中特有的一大类转录因子,包含4个亚家族(HD-ZIP I^IV),其中HD-ZIP I亚家族成员主要参与干旱、渗透压等极端环境和ABA及乙烯等激素处理的响应过程。本文采用隐马可夫模型(HMM)在玉米参考基因组中鉴定到17个HD-ZIP I亚家族成员,这些基因不均匀分布于玉米6条染色体上,与水稻的亲缘关系要近于拟南芥。玉米HDZIP I亚家族基因在玉米7种组织中表现出多种表达模式,具有明显的组织表达特异性。另外, HD-ZIP I亚家族基因对高盐、淹水及冷害等不同的逆境胁迫处理呈现出不同的响应模式及响应程度差异。5种不同激素处理后,玉米HD-ZIP I亚家族基因也表现出复杂的响应模式。这些结果为进一步解析玉米HD-ZIP I亚家族基因的生物学功能和作用机理提供了一定的参考价值。     

Response of industrial hemp to Salsola kali subsp. tragus densities under organic and conventional fertilisation

A 2-year field study was conducted to determine the effects of different nutrition systems and Salsola kali subsp. tragus densities on industrial hemp yield and its components. Experiments were conducted as a split plot in a randomised complete block design with three replicates. Factors were fertilisation (poultry manure, vermicompost and nitrogen fertiliser) as the main plot and weed density (0, 5, 10, 15 and 20 plants/m²) as the subplot. Results indicated that the maximum number of racemes per plant, seeds per raceme, 1000-seed weight, biomass, grain yield and harvest index (HI) of industrial hemp were obtained using vermicompost and were reduced with nitrogen fertiliser application. All measured properties in hemp plants decreased due to increasing S. kali subsp. tragus density, especially at 15 and 20 plants/m². The most significant reduction in hemp grain yield and its components was observed by increasing weed density with the application of nitrogen fertiliser. The application of vermicompost at high weed densities resulted in greater hemp grain yield and its components compared with nitrogen fertiliser. It is recommended to apply organic fertilisers, especially vermicompost at high S. kali subsp. tragus densities.     

拟穴青蟹Cactus基因的cDNA克隆、序列及生物学功能

为获取拟穴青蟹Cactus基因cDNA全长、分析基本生物学信息,并初步探索其在病原物刺激下的免疫反应,实验采用RACE技术获得了拟穴青蟹Cactus(SpCactus)基因的cDNA全长序列,其cDNA全长为2035 bp,开放阅读框(ORF)1311 bp,编码436个氨基酸,分子量为46.01 ku。对蛋白理化性质进行预测发现,SpCactus为亲水性蛋白,等电点pI为4.91。经预测,SpCactus与其他物种的IκB蛋白具有相似的功能结构域。同源性比对结果显示,SpCactus与凡纳滨对虾和中国明对虾的Cactus蛋白同源性均高达62%,相似度为73%。系统进化树分析显示,SpCactus与甲壳动物聚为一支,与无脊椎动物聚为一大支。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测发现,SpCactus基因在拟穴青蟹不同组织中均有表达,肌肉中的表达量最高,其次为心脏、眼柄、血液和鳃,肝胰腺中的表达量最低。LPS和金黄色葡萄球菌刺激均能显著诱导SpCactus基因的表达。本实验成功扩增了SpCactus基因全长,并进行了生物信息学分析、理化性质预测,初步探讨了其生物学功能,为进一步研究其在免疫反应中的生物学功能提供参考依据。